Metagenomics nghiên cứu tập hợp bộ gene của tất cả sinh vật trong mẫu môi trường. Thay vì phải phân lập, nuôi cấy từng loài riêng lẻ, Metagenomics cho phép phân tích xác định thành phần và dự đoán chức năng của hệ sinh vật trong mẫu.

KTest có các dịch vụ phân tích metagenomics như sau:

Giải trình tự đoạn ngắn gene 16S hệ vi khuẩn: cho phép phân tích hệ vi khuẩn trong mẫu dựa trên trình tự các vùng biến động của gene chỉ thị 16S.
Giải trình tự đoạn dài gene 16S hệ vi khuẩn: cho phép phân tích hệ vi khuẩn trong mẫu dựa trên trình tự toàn bộ gene 16S.
Giải trình tự đoạn dài gene ITS hệ vi nấm: cho phép phân tích hệ vi nấm trong mẫu dựa trên trình tự vùng ITS1 và ITS2.
Shotgun metagenomics (metagenome): cho phép phân tích toàn bộ hệ vi sinh trong mẫu (vi khuẩn, nấm, virus (DNA), một số sinh vật nhân thực).

Xem thông tin chi tiết về ưu nhược điểm các dịch vụ này ở website: https://www.ktest.vn/gtt-metagenomics

Tôi nên chọn giải trình tự mục tiêu 16S/ITS hay shotgun metagenomics ?

Lựa chọn phương pháp nào phụ thuộc vào đặc điểm mẫu cần phân tích, mục tiêu, ngân sách của đề tài. Hãy tham khảo cây quyết định bên dưới để lựa chọn phân tích phù hợp.

Hướng dẫn lựa chọn giải pháp metagen omics phù hợp cho dự án của bạn

Lựa chọn GTT gene 16S/ITS hệ vi khuẩn/nấm khi:
- Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn (16S) hoặc nấm (ITS)
- Ngân sách cho nghiên cứu hạn chế, nhưng cần thực hiện số lượng mẫu lớn
- Nền mẫu lẫn nhiều DNA “chủ” (rễ cây, mô,...)
- Mục tiêu: Kết quả phân loài không cần đến mức Loài (có thể hoặc không), tìm hiểu mức độ đa dạng sinh học và dự đoán chức năng tổng thể của một mẫu và so sánh với các mẫu khác trong nghiên cứu.
Lựa chọn shotgun metagenomics khi:

- Đối tượng nghiên cứu là mọi vi sinh vật (vi khuẩn, virus, vi nấm, nhân thực,…); yêu cầu phân loài đến mức Loài hoặc dưới Loài (Chủng)

- Ngân sách nghiên cứu đủ lớn

- Nền mẫu không lẫn nhiều DNA “chủ” hoặc chấp nhận chi phí cao để loại DNA vật chủ.

- Mục tiêu: Kết quả phân loài đến mức Loài hoặc Chủng, tìm hiểu mức độ đa dạng sinh học của mẫu và so sánh với các mẫu khác trong nghiên cứu, lắp ráp được bộ gene của một số vi sinh vật nổi trội, chức năng sinh học (các con đường biến dưỡng sinh học tiềm năng), chỉ thị sinh học (phân loài, phân tử sinh học, hoặc con đường biến dưỡng) đặc trưng cho nhóm mẫu.

- Shotgun metagenomics tùy mục tiêu và ngân sách có thể lựa chọn mức dung lượng giải khác nhau sẽ đạt được mức độ kết quả khác nhau.

Để tối ưu hoá chi phí, nhiều nghiên cứu được tiến hành theo hai bước: (1) Sàng lọc trên số lượng nghiệm thức/mẫu lớn bằng 16S/ITS metabarcoding, (2) Chọn lại một số nghiệm thức/mẫu tiềm năng để tiếp tục phân tích bằng shotgun metagenomics.

KTest giải trình tự gene 16S ở những vùng trình tự nào ? Giải bao nhiêu trình tự/mẫu ? Trình tự mồi là gì ?

Thay vì chỉ giải trình tự ở một vùng V3-V4, KTest có 2 cách tiếp cận:

Dịch vụ GTT 16S đoạn ngắn: Mồi 16S được sử dụng từ bộ kit xGen 16S Amplicon Panel v2 (IDT) là dạng hỗn hợp gồm 23 cặp, khuếch đại đa vùng V1-V9 của gene 16S. Vì sử dụng bộ kit của hãng nên KTest không cung cấp trình tự mồi. Do các sản phẩm ngắn nên được bộ kit khuyến nghị GTT trên hệ thống giải đoạn ngắn, khoảng 100,000 đoạn đọc 150PE.
Dịch vụ GTT 16S đoạn dài: mồi universal 27F, 1492R nhân bản toàn bộ trình tự gene 16S một cách liên tục (khoảng 1500bp) với khoảng 20,000 full-length read.

Tôi nên chọn GTT đoạn ngắn gene 16S đơn vùng hay đa vùng, hay GTT 16S đoạn dài ?

Phân tích 16S rRNA đơn vùng, vùng V3 -V4, vùng V1-V2, được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phân loài hệ vi khuẩn môi trường. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy phân tích đa vùng, tức phân tích trình tự của toàn bộ 9 vùng (V1-V9) “siêu biến động” trên gene 16S rRNA, giúp tăng khả năng phát hiện các phân loài hiện diện trong mẫu từ vài lần đến vài trăm lần trên nhiều loại môi trường như hệ vi sinh đường ruột người, hệ vi sinh biển, … so với phân tích đơn vùng.

Một số so sánh giữa cách tiếp cận đa vùng và đơn vùng.

Kumar, P. S., Brooker, M. R., Dowd, S. E., & Camerlengo, T. (2011). Target region selection is a critical determinant of community fingerprints generated by 16S Pyrosequencing. PLoS ONE, 6(6). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020956
Barb, J. J., Oler, A. J., Kim, H. S., Chalmers, N., Wallen, G. R., Cashion, A., Munson, P. J., & Ames, N. J. (2016). Development of an Analysis Pipeline Characterizing Multiple Hypervariable Regions of 16S rRNA Using Mock Samples. PLoS ONE, 11(2). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148047
Jones, C. B., White, J. R., Ernst, S. E., Sfanos, K. S., & Peiffer, L. B. (2022). Incorporation of Data From Multiple Hypervariable Regions when Analyzing Bacterial 16S rRNA Gene Sequencing Data. Frontiers in Genetics, 13. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.799615

So sánh giữa GTT đoạn ngắn gene 16S và GTT đoạn dài gene 16S

(1) Sự khác biệt quy trình/công nghệ dẫn đến khác biệt đầu ra

16S đoạn ngắn: thực hiện PCR nhân bản các vùng biến động của gene 16S => sản phẩm PCR ngắn => giải bằng công nghệ giải trình tự NGS đoạn đọc ngắn => phân loài chủ yếu ở mức chi (genus), cũng có ở mức loài (species) nhưng tỷ lệ phân loại ở mức loài rất ít.
16S đoạn dài: thực hiện PCR nhân bản toàn bộ trình tự gene 16S (mồi 27F, 1492R) => sản phẩm full-length gene 16S là 1500bp => giải bằng công nghệ giải trình tự đoạn đọc dài => tăng khả năng phân loại ở mức độ loại hơn 16S đoạn ngắn.

Công nghệ GTT đoạn ngắn thường sẽ có độ chính xác từng base (giải đúng base) sẽ cao hơn GTT đoạn dài nói chung, để có kết quả giải chính xác thì cần tăng độ phủ. Nhưng việc giải toàn bộ trình tự giúp 16S đoạn dài định danh loài tốt hơn 16S đoạn ngắn.

(2) Thời gian trả kết quả: 16S đoạn dài trả kết quả nhanh hơn, trong 2-3 tuần do flow cell nhỏ, không chờ quá lâu để gom mẫu; 16S đoạn ngắn dung lượng giải rất nhỏ so với các hệ máy giải NGS đoạn ngắn do đó thời gian trả kết quả thường dài hơn do cần thời gian gom mẫu/mẻ chạy.

(3) Chi phí: thường giải 16S đoạn dài có giá cao hơn 16S đoạn ngắn. Tuy nhiên nếu cỡ mẫu lớn thì chi phí tương đương.

(4) Khác: phương pháp 16S đoạn ngắn ra đời trước, nhiều nghiên cứu, bài báo thực hiện theo cách tiếp cận này điều này vừa có lợi (phương pháp thường gặp, nhiều công cụ phân tích) vừa có bất lợi (tính mới). Trong khi 16S đoạn dài chỉ mới ra đời 5-6 năm gần đây do công nghệ giải trình tự đoạn dài phổ biến hơn, rẻ hơn, càng ngày càng cải tiến độ khả năng đọc base chính xác hơn.

ASV là gì ? Vì sao các phân tích phân loài của KTest dựa trên khái niệm ASV mà không sử dụng OTU ?

Trong nghiên cứu metagenomics dựa trên gene mục tiêu (16S rRNA, ITS), hai khái niệm được sử dụng để nhận biết nguồn gốc phân loài của một trình tự giải là OTU (Operating Taxonomic Unit) và ASV (Amplicon Sequence Variant).

OTU là trình tự giải “đồng thuận” được xác định từ một nhóm trình tự giải tương đồng có thể đến từ một phân loài hoặc một nhóm phân loài có quan hệ gần về mặt tiến hoá. Mức độ tương đồng phổ biến là 97%. Cách tiếp cận này giúp bỏ qua những vị trí nucleotide sai do lỗi GTT. Tuy nhiên, điểm yếu của cách tiếp cận này là một số trình tự tuy đến từ các phân loài khác nhau nhưng lại có mức tương đồng đủ lớn và được xếp chung vào 1 OTU. Sai sót này làm giảm độ đa dạng sinh học thực sự của mẫu.
Cách tiếp cận ASV nhận diện từng trình tự giải và số lần trình tự đó được giải. Điều này cho phép đánh giá xác suất trình tự giải là có thật, không phải là một trình tự “nhân tạo” do lỗi GTT. Như vậy, khác với OTU là một trình tự đại diện cho một nhóm, mỗi ASV chỉ tương ứng với 1 trình tự.

Nhiều nghiên cứu hiện nay cho thấy cách tiếp cận ASV ngày càng được ưa chuộng hơn OTU vì : (1) phân loài chính xác hơn, (2) thể hiện mức đa dạng sinh học chính xác hơn, (3) kết quả phân loài có độ lặp lại tốt hơn và cho phép so sánh tốt hơn với các nghiên cứu khác có cùng cách tiếp cận, (4) cho phép phát hiện các trình tự “khảm” (do sự nối trong quá trình tạo thư viện) tốt hơn.

Dung lượng giải là gì? Tính dung lượng như thế nào ?

Trong GTT shotgun metagenomics, việc xác định dung lượng giải có ý nghĩa quan trọng. Dung lượng giải là tổng số trình tự được giải của mỗi mẫu trong một lần giải. Dung lượng càng cao thì thông tin càng đầy đủ và chính xác, nhưng chi phí cũng càng cao!

Các yếu tố cần quan tâm khi tính toán dung lượng giải bao gồm:

Chi phí tăng với mức tăng dung lượng; có thể cân nhắc sử dụng shallow shotgun thay thế
Ngưỡng phát hiện đối với các phân loài có mật số thấp càng thấp khi dung lượng càng tăng nghĩa là khả năng phát hiện càng tăng.
Khả năng nhận biết các SNV (single nucleotide variant) là các biến đổi nucleotide giúp phân biệt các Chủng trong cùng Loài sẽ tăng khi tăng dung lượng
Đặc điểm của mẫu, lẫn nhiều DNA “chủ” hoặc có sinh khối thấp sẽ cần mức dung lượng cao hơn.

Shallow shotgun metagenomics là gì ? được sử dụng ra sao ?

“Shallow shotgun metagenomics” là shotgun metagenomics với dung lượng thấp hơn 2-5 lần (nhỏ hơn 3Gb).

Ưu điểm:

Shallow shotgun có tính năng tương tự như shotgun metagenomics, nghĩa là có khả năng phân loài và dự đoán chức năng hệ vi sinh môi trường nhưng với chi phí thấp hơn nhiều.
Shallow shotgun lại phát hiện được nhiều phân loài hơn, kết quả có độ ổn định và lặp lại cao hơn, dự đoán chức năng tốt hơn so với 16S metabarcoding.

Hạn chế:

Shallow shotgun lại có một số hạn chế so với 16S metabarcoding trên các nền mẫu lẫn nhiều DNA “chủ” hoặc sinh khối thấp.
Shallow shotgun cũng không thể thay thế cho Shotgun dung lượng cao khi cần phát hiện phân loài mới, xác định phân loài đến mức Chủng, hoặc khi cần lắp ráp bộ gene các vi sinh vật trong mẫu.

Như vậy, shallow shotgun được sử dụng tốt nhất cho các nghiên cứu quy mô lớn khi chi phí GTT shotgun vượt quá khả năng. Đây được xem là cách tiếp cận trung gian giữa 16S metabarcoding và shotgun metagenomics.

KTest có nhận phân tích các con đường biến dưỡng hiện diện trong mẫu hay không ?

Shotgun metagenomics cho phép phát hiện các gene thuộc các con đường biến dưỡng, từ đó dự đoán chức năng của hệ vi sinh trong mẫu. KTest có nhận phân tích các con đường biến dưỡng có khả năng hiện diện trong mẫu. Tuy nhiên, khả năng phát hiện đầy đủ các gene này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dung lượng giải, đặc điểm sinh khối (cao hay thấp) của mẫu hay loại nền mẫu.

Nếu Quý khách quan tâm đến một con đường biến dưỡng nhất định, xin thông báo với bộ phận CSKH KTest để được tư vấn.

Có thể phát hiện mọi sinh vật với dịch vụ shotgun metagenomics không ?

Mặc dù về mặt lý thuyết Shotgun Metagenomics giải trình tự toàn bộ DNA có trong mẫu, nhưng không thể phát hiện 100% sinh vật có trong mẫu trong mọi trường hợp. Các rào cản kỹ thuật có thể có như sau:

Quy trình tách chiết DNA có tối ưu cho MỌI sinh vật ?
Độ sâu giải trình tự (Sequencing Depth) và Chi phí: Để phát hiện được các sinh vật cực hiếm trong mẫu phức tạp (như đất, bùn), hoặc các mẫu có nhiễm DNA vật chủ cao thì cần lượng dữ liệu rất lớn (hàng chục GB/mẫu). Nếu chạy với dung lượng thấp, các loài có tỷ lệ hiện diện quá thấp sẽ không được ghi nhận.
Giới hạn của cơ sở dữ liệu tham chiếu: Phần mềm tin sinh học phân loại bằng cách so sánh các đoạn đọc (reads) với cơ sở dữ liệu quốc tế. Nếu mẫu chứa loài hoàn toàn mới chưa từng được mã hóa gene hoặc chưa có tên trong cơ sở dữ liệu, phần mềm sẽ xếp chúng vào nhóm "Unclassified" (Chưa định danh) hoặc bỏ qua. Một số trường hợp chỉ phần loài đến mức Chi (genus).
Không phát hiện các virus có bộ gene RNA, trừ khi kết hợp phân tích metatranscriptomics.

Phân tích metagenomics sẽ thu được nhũng kết quả gì ? KTest có các kết quả mẫu không ?

Có. Phần lớn các dịch vụ của KTest có các kết quả mẫu (demo) và giải thích kết quả.

Kết quả mẫu Metegenomics (phân tích hệ sinh vật trong mẫu): https://www.ktest.vn/gtt-metagenomics
Webinar và video giải thích report: https://www.youtube.com/@ktestscienceco.ltd.1429/featured
Liên hệ bộ phần CSKH KTest nếu quý khách cần thông tin bổ sung.

Độ đa dạng alpha, đa dạng beta là gì ?

Độ đa dạng alpha (ALPHA DIVERSITY ) phản ánh mức độ đa dạng loài của 1 mẫu.

- Chỉ số Simpson: độ giàu – có bao nhiêu phân loài trong mẫu ?

- Chỉ số đồng đều: Các phân loài có cùng tỷ lệ phân bố ?

- Chỉ số Shannon kết hợp 2 chỉ số trên

Độ đa dạng beta (BETA DIVERSITY) thể hiện mức độ đa dạng khác biệt giữa nhiều mẫu.

- Chỉ số Jaccard: Có bao nhiêu phân loài giống nhau giữa các mẫu ?

- Khoảng cách Bray-Curtis: Các phân loải giống nhau giữa các mẫu có cùng tỷ lệ phân bố hay không ?

Webinar và video giải thích chi tiết: https://www.youtube.com/@ktestscienceco.ltd.1429/featured

KTest có đưa ra các khuyến cáo cụ thể về cỡ mẫu, loại mẫu cần thu hay không ?

KTest có thể tư vấn về nghiệm thức và thiết kế nghiên cứu chung. Cỡ mẫu, loại mẫu cần thu và cách thu mẫu phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, các điều kiện thực tế và nguồn lực của khách hàng.

Nếu quý khách cần thảo luận về các vấn đề trên, xin liên hệ với bộ phận CSKH KTest để được tư vấn.

Cỡ mẫu cho nghiên cứu metagenomics nên được tính toán ra sao ?

Cỡ mẫu của một nghiên cứu phụ thuộc nhiều yếu tố như mục tiêu nghiên cứu, nguồn lực có thể có, đặc tính của mẫu, … Việc tham khảo những công bố khoa học có giá trị trên chủ đề tương tự như nghiên cứu cần tiến hành là một chỉ dẫn quý báu về nhiều thông tin trong đó có cỡ mẫu để thu được kết quả đáng tin cậy về mặt thống kê.

Bên cạnh đó, một mẫu metagenomic cần được thu ít nhất là 3, có thể tăng đến 5 lần lặp lại.

Nếu quý khách cần thảo luận về các vấn đề trên, xin liên hệ với bộ phận CSKH KTest để được tư vấn.

Để giải trình tự Metagenomics tôi cần chuẩn bị mẫu như thế nào ? KTest có dịch vụ tách chiết DNA không ?

KTest có dịch vụ tách chiết DNA, do đó KTest có thể nhận các mẫu thô (đất, nước, chế phẩm sinh học, ruột tôm/cá, rễ, thực phẩm, phân, que phết, mô,...) hoặc mẫu DNA đã tách chiết, sản phẩm PCR,...

Vui lòng xem hướng dẫn chi tiết về yêu cầu mẫu, cách bảo quản, đóng gói và vận chuyển mẫu đến KTest ở link:

https://l1nq.com/huongdanchuanbimaumetagenomics

Tôi muốn giải trình tự Metagenomics tại KTest thì cần làm gì ?

Quy trình dịch vụ của KTest gồm 9 bước như mô tả ở hình bên dưới. Vui lòng liên hệ bộ phận Tư vấn của KTest để thực hiện Bước 1. Tư vấn thông tin.

Số điện thoại: 0979.686.746 hoặc 0915.033.254

Email: cskh@ktest.vn hoặc info@ktest.vn

Giải trình tự Metagenomics giá bao nhiêu 1 mẫu ?

Chi phí dịch vụ phụ thuộc nhiều yếu tố như loại mẫu, số lượng mẫu, loại dịch vụ, dung lượng, các yêu cầu về phân tích tin sinh học, …
Khách hàng có thể trải nghiệm GTT gene 16S hệ vi khuẩn chỉ từ 1,x - 3,x triệu/mẫu; Shotgun metagenomics chỉ từ 3,x triệu/mẫu.

Xin liên hệ với bộ phận CSKH KTest để nhận được tư vấn và báo giá phù hợp tại https://www.ktest.vn/tu-van